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减毒活菌卡介苗对哮喘TLR4表达的影响

减毒活菌卡介苗对哮喘TLR4表达的影响

【摘要】目的观察减毒活菌卡介苗(BCG)对哮喘小鼠肺组织TLR4表达的影响,以探讨BCG对哮喘治疗的可能作用机制。方法昆明小鼠建立哮喘模型并多次BCG接种,WesternBlotting检测肺组织TLR4的表达。结果BCG干预组小鼠TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比增强。结论卡介苗对哮喘的治疗作用可能与肺组织TLR4上调有关。

【关键词】卡介苗;哮喘;TLR4

哮喘存在有气道高反应性、IgE调节和特异性反应基因。Toll样受体是在哺乳动物中发现的与果蝇有同源性的蛋白,命名为TLR,最初发现的TLR4是目前研究最多的[1]。研究证实,BCG其分枝杆菌脂蛋白能与巨噬细胞上Toll样受体结合,促进巨噬细胞产生IL12、IFNγ,抑制IL4、IL5的产生,从而纠正哮喘中Th1/Th2亚群数目和(或)功能失衡[2]。本实验意在研究BCG对哮喘小鼠模型中肺组织TLR4的影响,为临床哮喘治疗提供新的研究方向及思路,并将发现以TLRs和其信号途径作为靶点去治疗、干预多种疾病的新方法。

1材料与方法

11实验动物与试剂

昆明种小白鼠、卵白蛋白(OVA,GradeⅡ)、减毒活菌卡介苗(BCG)、抗TLR4单克隆抗体、抗GAPDH单克隆抗体、HRP标记的小鼠IgG抗体等。

12实验动物的分组及致敏模型制备

实验动物随机分为三组,分别为空白对照组、哮喘发病组和BCG干预组,每组10只小鼠。哮喘发病组:第1、7、14天腹腔注射008%OVA致敏,每次02ml,Al(OH)3作为免疫佐剂。第15天开始雾化激发;BCG干预组:哮喘模型的建立同哮喘发病组,在每次致敏前1d和最后雾化激发1h内BCG皮内注射再次干预,每次剂量为0025mg;空白对照组:用生理盐水代替OVA。所有小鼠在最后一次激发24h后获取标本。

13小鼠肺组织TLR4蛋白的WesternBlotting检测

取各组实验小鼠肺组织提取总蛋白,测定浓度。各组蛋白样品SDSPAGE电泳后,电转移至PVDF膜上。PVDF膜经封闭2h后,用稀释后的TLR4单克隆抗体,4℃孵育过夜。再进一步与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育后,滴加化学发光底物,X光胶片感光检测蛋白信号。

14统计学方法

所有实验结果采用SPSS100软件进行统计分析,计量数据以(x±s)的形式表示。组间差异采用t检验。

图1

各组小鼠肺组织中TLR4蛋白表达的WesternBlotting鉴定

1为空白对照组,2为哮喘发病组,3为BCG干预组,GAPDH蛋白为内参照

2结果

TLR4蛋白在空白对照组的肺组织中仅有微量的表达,哮喘发病组中TLR4蛋白的表达量较对照组略有升高,而BCG干预组中TLR4蛋白的表达量较前两组均有显著的增强(灰度分析数据未显示)。

3讨论

BCG为结核杆菌的减毒活疫苗,其主要成分是卡介苗核糖核酸。研究证实[3],TLR4的配体结合TLR4后,通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内,产生复杂的级联信号反应,其中TLR4NFKB信号途径参与细胞免疫应答、炎性反应和抗凋亡相关基因的转录是细胞免疫学领域的研究热点。但BCG是否也能通过TLR4途径介导并激活Th1型免疫反应尚不清楚。

我们通过实验发现经BCG干预后,TLR4基因表达量与空白对照组以及哮喘发病组相比均有显著升高。BCG可能是通过刺激TLR4表达上调,进而调节Th1/Th2平衡,在哮喘发病的治疗中发挥重要作用。而关于BCG作为TLR4的配体如何发挥功能仍需进一步的实验研究验证。

参考文献

[1]MikkoHallman,MikaRmet,etalTollLikeReceptorsAsSensorsOfPathogensPediatricResearch,2001,50(3)

[2]ISChoi,YIKohEffectsofBCGrevaccinationonasthmaAllergy,2003,58:1114–1116

[3]AnDeCreus,MasanoriAbe,etalLowTLR4ExpressionbyLiverDendriticCellsCorrelateswithReducedCapacitytoActivateAllogeneicTCellsinResponsetoEndotoxin1TheJournalofImmunology,2005,174:2037–2045